适用范围

用于细胞凋亡检测

产品介绍

Cell Meter™活细胞半胱天冬酶活性检测试剂盒采用荧光FMK半胱天冬酶抑制剂的检测原理。该抑制剂具有细胞膜通透性和非细胞毒性特性，进入细胞后可共价结合活性半胱天冬酶。

Cell Meter 活细胞Caspase 1结合检测试剂盒专为通过检测活细胞中caspase 2的活化水平来监测细胞凋亡而设计，适用于定量分析凋亡细胞的caspase 2活性，或用于筛选caspase 2抑制剂。试剂盒中的绿色荧光标记物FAM- VDVAD-FMK可直接通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测凋亡细胞中激活的caspase 2。本试剂盒提供所有必需组分及经过优化的检测方案。

实验方案

1.根据特定的诱导方案培养细胞至适合凋亡诱导的密度，但不超过 2×10⁶个细胞 /mL。同时，对于每种标记条件，培养与诱导组密度相同的未诱导阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3）用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.按 1:150 的比例向细胞溶液中加入 150X FAM-VDVAD-FMK 储备液，将细胞置于 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 1 小时。

注 a.用于 FAM-VDVAD-FMK标记的细胞可浓缩至约 5×10⁶个细胞 /mL。

    b.对于贴壁细胞，用 0.5 mM EDTA 轻轻吹打细胞以保持细胞完整，在与 FAM-VDVAD-FMK孵育前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

    c.合适的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度，需为每个实验优化孵育时间。

3.以约 200g 的离心力离心细胞 5 分钟，用 1 mL 洗涤缓冲液（组分 B）洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于适量的洗涤缓冲液中。

注1：FAM-VDVAD-FMK具有荧光，因此必须洗去所有未结合的试剂以消除背景干扰。对于悬浮细胞，应将细胞浓度调整为每块微量滴定板的每个孔中 2-5×10⁵个细胞 / 100 µL。

4.如果需要，可用DNA染色标记细胞（例如用 碘化丙啶标记死细胞，或用 Hoechst 标记全细胞群的细胞核）

5.通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪监测荧光强度，参数如下：

FAM-VDVAD-FMK：Ex/Em=490/525 nm

碘化丙啶：Ex/Em=535/635 nm

Hoechst 染料：Ex/Em=350/461 nm

流式细胞仪

使用FL1的通道监测荧光强度（碘化丙啶染色使用FL2通道）。圈选目标细胞群，排除细胞碎片。

荧光显微镜

将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔黑色微量滴定板的每个孔中。在荧光显微镜下观察细胞，其中FAM-VDVAD-FMK使用 FITC 通道（碘化丙啶染色使用TRITC通道，Hoechst染色使用DAPI通道）。

荧光酶标仪

将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔黑色微量滴定板的每个孔中。使用荧光酶标仪（底部读数模式）在 Ex/Em = 490/525 nm（截止波长 = 515 nm）处监测荧光强度。

注意：若需要平衡细胞浓度，可调整诱导组细胞的悬液体积，使其细胞密度接近未诱导组。如果细胞处理不会导致刺激组细胞数量大幅减少，此调整步骤可省略。