CRISPR KI(Tag)
产品名称： CRISPR KI(Tag)
英文名称： CRISPR KI(Tag)
产品编号： IC4
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品牌商标： null
更新时间： 2025-08-15T14:27:06
使用范围： null
启东芳景生物科技有限公司
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CRISPR KI(Tag)
通过CRISPR和donor质粒(同源臂+插入序列)的共同作用，实现对靶点进行切割的同时，通过HR介导的同源重组修复方式，精确插入外源序列的目的。多适用于内源基因N或C端插入标签基因(Tag)，以分析和获取该基因的表达模式。
提供两种技术方案，根据有无筛选标记(marker)区分：
| 无marker | 有marker | |
| 获得阳性方式 | 分子鉴定 | 表型筛选(眼睛的RFP) |
| 效率 | 略高 | 略低 |
| 筛选阳性通量 | 大部分F1代 | 全部F1代 |
| 成功率 | 较高 | 较高 |
| 编辑后序列 | 精确，无多余序列 | 移除后残留34bp的loxP |
| 周期 | 短 | 长(需要marker移除) |
| 价格 | 相对高(分子鉴定成本高) | 相对低(阳性筛选方便) |
| 适用范围 | 广泛 | 仅针对C端插入 |
| CRISPR KI-tag(with marker) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
0 |
| donor质粒载体构建 | 1.arm载体构建：无缝克隆连接 载体：Amp抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor载体构建：无缝克隆连接 载体：arm载体PCR线性化，并在gRNA识别位置引入点突变 片段：插入序列 + loxP-3P3-RFP-loxP marker(LRL) 3.Donor质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎数量：400-500个 |
2 |
| 杂交和筛选 | 1.P0果蝇与平衡子杂交 2.筛选F1阳性果蝇(3P3-RFP) |
2 |
| 分子鉴定 | 插入序列和基因组插入位置PCR和测序鉴定 | 0 |
| marker移除和构建稳定品系 | 1.F1阳性果蝇杂交平衡子 2.构建RFP稳定/纯合品系 3.F2果蝇与CRE内源表达品系杂交 4.子代F3挑选无RFP果蝇杂交平衡子，并进行PCR和测序鉴定确保RFP移除 5.构建marker移除的稳定/纯合品系 |
10~12 |
| 合计 | 18~21 |
| CRISPR KI-tag(without marker) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
0 |
| donor质粒载体构建 | 1.arm载体构建：无缝克隆连接 载体：Amp抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor载体构建：无缝克隆连接 载体：arm载体PCR线性化，并在gRNA识别位置引入点突变 片段：插入序列 3.Donor质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎数量：400-500个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1.P0果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR鉴定 2.阳性P0的子代F1果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR和测序鉴定 3.阳性F1的子代F2果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR鉴定 4.阳性F2的子代F3果蝇自交构建稳定/纯合品系 |
8~10 |
| 合计 | 14~17 |